植物轉錄因子研究

      轉錄因子（TF）是一類(lèi)具有特殊結構的蛋白質(zhì)，也稱(chēng)為反式作用因子。通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區域的順式作用元件特異性結合，行使調控基因表達的功能。典型的轉錄因子一般具有4個(gè)功能結構域：DNA結合區（DNA-binding domain，DBD）、轉錄調控區（transcription regulation domain，TRD）、寡聚化位點(diǎn)區（oligomerization site，OS）以及核定位信號區（nuclear localization signal，NLS）。這些結構域決定了轉錄因子的功能和特性（Liu et al., 1999）。轉錄因子結合位點(diǎn)（TFBS）是與轉錄因子結合的靶基因上游5'端特殊的一段DNA序列，也稱(chēng)為DNA結合基序（motif）。一個(gè)轉錄因子往往同時(shí)調控若干個(gè)基因，在不同基因上TFBS具有一定的保守性，但又具有一定的差異。

      植物轉錄因子在植物的生長(cháng)發(fā)育、形態(tài)建成、響應外界環(huán)境變化等方面起重要的調節作用，而且在植物性狀改良和新品種培育方面具有廣闊的應用前景（Yang et al., 2004）。因此，近些年來(lái)，轉錄因子在植物基因轉錄調控研究領(lǐng)域備受大家的關(guān)注，是研究的熱點(diǎn)之一。

植物通過(guò)信號轉導途徑響應非生物和生物脅迫（Hrmova et al., 2021）

     植物受到非生物脅迫（例如：干旱、熱、鹽、冷）和生物脅迫（例如：病毒、細菌、真菌、昆蟲(chóng)）后，通過(guò)細胞膜表面的受體感知脅迫信號，進(jìn)而激活信號轉導。信號級聯(lián)反應（例如：第二信使激活、激酶活化、磷酸化/去磷酸化）的發(fā)生，調控多種轉錄因子及應激反應基因的轉錄與表達，從而介導脅迫的耐受和抵抗，并恢復細胞和組織穩態(tài)。

在植物非生物脅迫（干旱和鹽）信號通路中，轉錄因子作為轉錄調控網(wǎng)絡(luò )關(guān)鍵組成部分的示意圖（Hussain et al., 2021）

植物轉錄因子可分為多個(gè)家族（例如：AP2/ERF、bHLH、bZIP、HD-Zip、MYB、NAC、WRKY、MADS等），且數量繁多，功能多樣，增加了轉錄因子的研究難度。

植物轉錄因子研究策略及常用的實(shí)驗方法

在此，我們總結了植物轉錄因子的研究策略和方法。希望可以為模式植物及非模式植物中，轉錄因子對基因的轉錄調控機制研究增磚添瓦。

    藍景科信專(zhuān)注為國內高等院校和研究機構提供創(chuàng )新的技術(shù)解決方案和應用工具。尤其是對于分子間相互作用的研究，例如：DNA親和純化測序（DAP-seq），該技術(shù)可高通量地檢測轉錄因子及DNA結合蛋白在基因組上的結合位點(diǎn)，鑒定下游靶基因。我們擁有100+物種，1000+轉錄因子的DAP-seq實(shí)驗經(jīng)驗。在DAP-seq技術(shù)服務(wù)領(lǐng)域我們的客戶(hù)有中國科學(xué)院植物所、遺傳發(fā)育所、動(dòng)物所、中國農科院畜牧所、棉花所、果樹(shù)所、基因組所、中國林科院、中國農業(yè)大學(xué)、浙江大學(xué)等幾十所高等院?；蚩蒲袡C構。而且，使用該技術(shù)已助力客戶(hù)在許多期刊成功發(fā)表文章，例如：Molecular Plant，The Plant Cell，Plant Physiology，Plant Biotechnology Journal，Journal of Integrative Plant Biology，New Phytologist等。

下面，我們將結合具體的文章案例對植物轉錄因子研究套路進(jìn)行剖析和解讀。

文章案例（一）

文章題目：Phytochrome interacting factor regulates stomatal aperture by coordinating red light and abscisic acid

發(fā)表期刊：The Plant Cell

1. 篩選轉錄因子OsPIL15

根據前期研究基礎，找到一個(gè)轉錄因子水稻PIF家族成員OsPIL15。該轉錄因子參與水稻氣孔運動(dòng)的調節機制尚不清楚。

2. 研究OsPIL15的基因功能

通過(guò)OsPIL15過(guò)表達和敲除突變體株系的表型觀(guān)察、蒸騰作用相關(guān)生理指標檢測分析、突變體回補實(shí)驗、不同光照處理后的生理指標檢測分析，得出結論OsPIL15通過(guò)促進(jìn)氣孔閉合進(jìn)而負調節蒸騰作用，并且OsPIL15參與了紅光/遠紅光誘導的水稻氣孔孔徑調節。進(jìn)一步采用ABA處理后表型觀(guān)察、生理指標檢測分析、內源ABA含量測定，明確了OsPIL15參與ABA誘導的氣孔關(guān)閉過(guò)程。

3. 鑒定轉錄因子OsPIL15的下游靶基因

主要實(shí)驗：RNA-seq、RT-qPCR、DAP-seq、RNA-seq與DAP-seq聯(lián)合分析、雙熒光素酶報告（Dual-Luc）實(shí)驗、電泳遷移率測定（EMSA）實(shí)驗、OsABI5啟動(dòng)子序列分析、OsABI5的突變體株系實(shí)驗

通過(guò)上述一系列實(shí)驗，得出實(shí)驗結論：OsABI5是OsPIL15調控氣孔運動(dòng)的直接靶基因。

OsABI5是OsPIL15調控氣孔孔徑的直接靶點(diǎn)

A. DAP-seq鑒定了水稻OsPIL15結合的保守結合基序PBE-box：CACATG；B. 各株系置于不同光照處理下OsABI5的相對表達水平；C和D. Dual-Luc實(shí)驗說(shuō)明OsPIL15誘導了OsABI5的轉錄：C. Dual-Luc載體構建示意圖、D. 相對熒光強度；E和F. EMSA實(shí)驗說(shuō)明OsPIL15與OsABI5啟動(dòng)子區的PBE-box結合：E. OsABI5啟動(dòng)子示意圖（紅色標注PBE-box）、F. EMSA結果（黑色箭頭為結合條帶）；G-I. 利用水稻OsABI5突變體株系研究OsABI5基因對蒸騰作用的影響：G. 蒸騰速率、H. 氣孔導度、I. 水分利用效率（iWUE）。

4. 鑒定OsPIL15上游調節因子

主要實(shí)驗：酵母雙雜交（Y2H）實(shí)驗、雙分子熒光互補（BiFC）實(shí)驗、Pull down實(shí)驗、互作蛋白OsHHO3的突變體株系實(shí)驗、雜交雙突變體Ospil15-2 Oshho3-2的株系實(shí)驗、Dual-Luc實(shí)驗、RT-qPCR實(shí)驗

通過(guò)上述一系列實(shí)驗，得出實(shí)驗結論：OsHHO3與OsPIL15結合，協(xié)同調節氣孔運動(dòng)。

OsHHO3與OsPIL15相互結合協(xié)同調節氣孔運動(dòng)

A. Y2H實(shí)驗；B. BiFC實(shí)驗；C. Pull down實(shí)驗；D-H. 利用水稻OsHHO3敲除突變體株系研究OsHHO3基因對蒸騰作用的影響：D. 蒸騰速率、E. 氣孔導度、F. iWUE、G. 三種不同開(kāi)度氣孔的百分比、H. 氣孔空隙面積（SPA）；I-K. 比較單突變體Ospil15-2、Oshho3-2和雜交雙突變體Ospil15-2 Oshho3-2之間蒸騰作用的差異：I. 蒸騰速率、J. 氣孔導度、K. iWUE；L. 比較OsABI5基因在各突變體株系中的相對表達水平；M和N. Dual-Luc實(shí)驗：M. Dual-Luc載體構建示意圖、N. 相對熒光強度。

5. 研究玉米中同源基因的功能（拓展轉錄因子研究廣度）

通過(guò)EMS誘變獲得玉米突變體株系，隨后開(kāi)展一系列表型觀(guān)察和生理指標檢測分析，最終得出結論：ZmPIF1和ZmPIF3具有調節玉米氣孔開(kāi)度的功能，因此PIFs介導的氣孔開(kāi)度調控機制在植物中可能是保守的。

6. 構建OsPIL15調控的分子機制模型

該研究發(fā)現了水稻轉錄因子OsPIL15與OsHHO3相互作用，促進(jìn)水稻OsABI5的轉錄。OsPIL15通過(guò)與OsABI5啟動(dòng)子的PBE-box基序結合調控氣孔開(kāi)度。此外，與OsPIL15同源的玉米PIF家族基因ZmPIF1和ZmPIF3也負調控玉米的氣孔開(kāi)度，表明PIF調控的氣孔運動(dòng)在植物中可能是保守的。

OsPIL15通過(guò)協(xié)調紅光和ABA信號調節氣孔運動(dòng)的機制模式圖

在晚上phy轉化為不活躍的Pr形式，并定位于細胞質(zhì)，導致OsPIL15在細胞核中積累。OsPIL15通過(guò)與OsABI5啟動(dòng)子結合，增強OsABI5的轉錄，促進(jìn)水稻氣孔關(guān)閉，降低蒸騰作用。此外，OsHHO3與OsPIL15相互作用，促進(jìn)OsPIL15與OsABI5啟動(dòng)子的結合。在白天紅光促進(jìn)phys轉化為活躍的Pfr形式，并遷移到細胞核中，于是OsPIL15蛋白被細胞核中的Pfr降解，不再誘導OsABI5的表達，從而促進(jìn)水稻氣孔開(kāi)放，提高蒸騰作用。

文章小結：該研究揭示了PIFs在紅光介導的氣孔運動(dòng)中發(fā)揮作用的分子機制，并證明了PIFs可以通過(guò)協(xié)調紅光和ABA信號傳導來(lái)調節氣孔開(kāi)度。

文章案例（二）

文章題目：Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus

發(fā)表期刊：Plant Physiology

1. 篩選轉錄因子PtoWRKY68

對不同自然種群的300份中國白楊材料進(jìn)行干旱相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），篩選到顯著(zhù)相關(guān)的SNP位點(diǎn)及其關(guān)聯(lián)基因PtoWRKY68（WRKY家族轉錄因子）?；虮磉_水平分析和轉基因擬南芥株系實(shí)驗表明PtoWRKY68是一個(gè)植物耐旱性的正調控因子。

2. 研究PtoWRKY68等位基因的功能

基于PtoWRKY68基因的序列變異分析，將毛白楊分為兩個(gè)單倍型類(lèi)群：PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2。通過(guò)等位基因頻率調查分析、基因表達水平檢測、干旱相關(guān)性狀分析、轉基因擬南芥株系實(shí)驗，發(fā)現PtoWRKY68^hap1（耐旱等位基因）的耐旱性強于PtoWRKY68^hap2（干旱敏感等位基因），而且二者對干旱脅迫響應的差異并不是由于PtoWRKY68等位基因表達水平的差異所致，可能與等位基因變異對干旱脅迫的不同響應機制有關(guān)。

3. 鑒定轉錄因子PtoWRKY68的下游靶基因

主要實(shí)驗：RNA-seq、共表達網(wǎng)絡(luò )分析、DAP-seq、RNA-seq與DAP-seq聯(lián)合分析、Dual-Luc實(shí)驗、EMSA實(shí)驗、楊樹(shù)種群及轉基因擬南芥株系中的靶基因表達水平分析、ABA敏感實(shí)驗、干旱脅迫相關(guān)生理指標檢測

基于上述一系列實(shí)驗分析，鑒定了PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2的結合基序（分別是W1-box、W2-box）及其靶基因（PtoDTX49.1、PtoABF2.1和PtoRD26.1）。PtoWRKY68介導了靶基因在干旱脅迫下的轉錄調控，且相比于PtoWRKY68^hap2，PtoWRKY68^hap1對靶基因啟動(dòng)子具有更高的親和力。干旱脅迫下PtoWRKY68^hap1通過(guò)增強干旱脅迫信號通路和ABA信號通路以及減少ABA外排，從而增加細胞中ABA積累，最終增強植物的耐旱性。

DAP-seq鑒定PtoWRKY68等位基因的靶基因

A. 水分充足及干旱脅迫下的基因共表達網(wǎng)絡(luò )模塊，在重疊基因中包含了PtoWRKY68；B和C. DAP-seq分析PtoWRKY68^hap1(B)和PtoWRKY68^hap2(C)的peaks在基因組上的分布；D和E. PtoWRKY68^hap1(D)和PtoWRKY68^hap2(E)的結合基序分別是W1-box和W2-box；F和G. PtoWRKY68^hap1(F)和PtoWRKY68^hap2(G)的靶基因富集的KEGG通路；H. Venn圖顯示有3個(gè)重疊基因；I-K. 箱型圖展示3個(gè)靶基因PtoRD26.1、PtoDTX49.1、PtoABF2.1的相對表達水平(FPKM值)。

4. 鑒定PtoWRKY68上游調節因子

主要實(shí)驗：數量性狀位點(diǎn)（eQTL）分析、EMSA實(shí)驗、Dual-Luc實(shí)驗

eQTL分析發(fā)現PtoSVP.3受干旱脅迫誘導表達，其表達水平與PtoWRKY68呈正相關(guān)。EMSA和Dual-Luc實(shí)驗驗證了PtoSVP.3通過(guò)與PtoWRKY68啟動(dòng)子區域的CArG基序結合，促進(jìn)PtoWRKY68的表達。

5. 構建PtoWRKY68調控的分子機制模型

提出了PtoWRKY68調控楊樹(shù)耐旱性的分子機制模型PtoSVP.3-PtoWRKY68-PtoDTX49.1/PtoABF2.1/PtoRD26.1。為應對干旱脅迫，PtoSVP.3正向調控PtoWRKY68，PtoWRKY68等位基因通過(guò)誘導PtoRD26.1和PtoABF2.1的表達以及抑制PtoDTX49.1的表達，進(jìn)而調控ABA信號傳導和積累來(lái)增強楊樹(shù)的耐旱性。

PtoWRKY68調控楊樹(shù)耐旱性的分子機制模型

在干旱脅迫下，PtoWRKY68等位基因受PtoSVP.3的正向調控，PtoWRKY68^hap1（上圖）等位基因變異增強了對PtoRD26.1和PtoABF2.1的結合和激活，抑制PtoDTX49.1，從而調節ABA外排和信號轉導來(lái)獲得耐旱性。相比于PtoWRKY68^hap1，PtoWRKY68^hap2（下圖）對下游靶點(diǎn)具有較低的結合親和力和激活能力。因此，具有PtoWRKY68^hap1等位基因的楊樹(shù)材料其抗旱性?xún)?yōu)于具有PtoWRKY68^hap2等位基因的楊樹(shù)材料。

文章小結：該研究提出了PtoWRKY68調控楊樹(shù)耐旱性的分子機制。該調控模塊的鑒定為深入了解楊樹(shù)耐旱性的遺傳基礎提供了新見(jiàn)解，并為利用分子育種技術(shù)開(kāi)發(fā)耐旱樹(shù)木新品種提供了潛在的靶點(diǎn)。

文章案例（三）

文章題目：Overexpression of the transcription factor MdWRKY115 improves drought and osmotic stress tolerance by directly binding to the MdRD22 promoter in apple

發(fā)表期刊：Horticultural Plant Journal

1. 篩選轉錄因子MdWRKY115

基于蘋(píng)果基因組數據，分析了WRKY基因家族成員，并克隆了蘋(píng)果基因MdWRKY115。序列比對和系統進(jìn)化分析表明MdWRKY115是第Ⅲ組WRKY家族轉錄因子。

2. 驗證轉錄因子MdWRKY115

qRT-PCR結果表明干旱和滲透脅迫下MdWRKY115表達上調。GUS活性分析表明在滲透脅迫下MdWRKY115的啟動(dòng)子活性明顯增強。亞細胞定位分析發(fā)現MdWRKY115定位于細胞核。轉錄激活分析結果證明了MdWRKY115是一個(gè)轉錄激活因子。

3. 研究MdWRKY115的基因功能

轉基因株系的表型分析表明，在擬南芥幼苗和蘋(píng)果愈傷組織中過(guò)表達MdWRKY115，顯著(zhù)提高了它們對干旱和滲透脅迫的耐受性。

4. 鑒定轉錄因子MdWRKY115的下游靶基因

主要實(shí)驗：DAP-seq、EMSA實(shí)驗、轉基因蘋(píng)果愈傷組織中靶基因表達水平檢測

DAP-seq鑒定了MdWRKY115的結合元件是W-box基序（核心序列TTGAC）以及與脅迫相關(guān)的靶基因MdRD22。EMSA驗證了MdWRKY115與MdRD22啟動(dòng)子的特異性結合。對轉基因蘋(píng)果愈傷組織檢測發(fā)現，過(guò)表達MdWRKY115能夠促進(jìn)MdRD22的表達。因此，MdWRKY115通過(guò)直接與MdRD22的啟動(dòng)子結合，調控其表達。

MdWRKY115直接結合MdRD22啟動(dòng)子，調控其表達

A. DAP-seq鑒定了MdWRKY115的DNA結合基序W-box；B.EMSA驗證了MdWRKY115與靶基因MdRD22啟動(dòng)子的結合；C.轉基因蘋(píng)果愈傷組織中MdRD22的表達差異說(shuō)明MdWRKY115的過(guò)表達促進(jìn)了MdRD22的表達上調。

5. 構建MdWRKY115調控的分子機制模型

該研究鑒定了蘋(píng)果中與干旱和滲透脅迫耐受性相關(guān)的轉錄因子MdWRKY115。MdWRKY115通過(guò)與MdRD22啟動(dòng)子結合，調控MdRD22的表達，提高了轉基因擬南芥和蘋(píng)果愈傷組織對干旱和滲透脅迫的耐受性。

文章小結：該研究提出了MdWRKY115通過(guò)調控MdRD22的表達增強蘋(píng)果對干旱和滲透脅迫耐受性的分子機制，這對利用分子遺傳策略培育耐旱植物新品種具有重要意義。

參考文獻：

Liu L, White MJ, MacRae TH. Transcription factors and their genes in higher plants functional domains, evolution and regulation. Eur J Biochem. 1999 Jun;262(2):247-57. doi: 10.1046/j.1432-1327.1999.00349.x.

Yang ZR, Wang XC, Li XM, Yang CD. [Transcription factors in higher plant]. Yi Chuan. 2004 May;26(3):403-8. Chinese.

Hrmova M, Hussain SS. Plant Transcription Factors Involved in Drought and Associated Stresses. Int J Mol Sci. 2021 May 26;22(11):5662. doi: 10.3390/ijms22115662.

Hussain Q, Asim M, Zhang R, Khan R, Farooq S, Wu J. Transcription Factors Interact with ABA through Gene Expression and Signaling Pathways to Mitigate Drought and Salinity Stress. Biomolecules. 2021 Aug 5;11(8):1159. doi: 10.3390/biom11081159.

以下參考文獻中的DAP-seq技術(shù)支持由藍景科信提供。

Li Q, Zhou L, Chen Y, Xiao N, Zhang D, Zhang M, Wang W, Zhang C, Zhang A, Li H, Chen J, Gao Y. Phytochrome interacting factor regulates stomatal aperture by coordinating red light and abscisic acid. Plant Cell. 2022. 34: 4293-4312. doi: 10.1093/plcell/koac244.

Fang Y, Wang D, Xiao L, Quan M, Qi W, Song F, Zhou J, Liu X, Qin S, Du Q, Liu Q, El-Kassaby YA, Zhang D. Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus. Plant Physiol. 2023 May 29:kiad315. doi: 10.1093/plphys/kiad315.

Dong Q, Tian Y, Zhang X, Duan D, Zhang H, Yang K, Jia P, Luan H, Guo S, Qi G, Mao K, Ma F, Overexpression of the transcription factor MdWRKY115 improves drought and osmotic stress tolerance by directly binding to the MdRD22 promoter in apple, Horticultural Plant Journal. doi: 10.1016/j.hpj.2023.05.005.