雜交捕獲的原理是人工設計探針(DNA探針或者RNA探針),探針可以和目標區段部分或者全部互補。將樣本和探針混合,探針會(huì )將目標區段捕獲,未設計探針的區段會(huì )被洗脫丟棄,之后通過(guò)變性(一般是調節PH值到堿性)將探針和捕獲區段分開(kāi),被捕獲的片段即可進(jìn)行二代測序文庫構建。
雜交捕獲流程介紹:
1、文庫制備
將提取后的基因組DNA利用超聲或酶切的方法將基因組DNA進(jìn)行片段化,并進(jìn)行末端修復和接頭連接,接著(zhù)進(jìn)行PCR及純化。
2、雜交反應
將帶有生物素標記的RNA/DNA探針,對DNA文庫的目標區域片段進(jìn)行結合(探針應過(guò)量)。
3、鏈霉親和素磁珠結合
使用鏈霉親和素磁珠結合帶有生物素標記的RNA/DNA探針與DNA文庫相結合的雙鏈復合物。
4、清洗
利用不同鹽濃度的緩沖液進(jìn)行多次清洗,主要目的為去除未被探針捕獲的非特異性雜交,保留目標區域的DNA從而達到捕獲效率的提升。
5、捕獲后擴增
對捕獲及清洗后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴增,構建完成靶向富集的測序文庫。
雜交捕獲的優(yōu)缺點(diǎn)都是什么呢?
優(yōu)點(diǎn):捕獲區段大,可以達到幾百MB,遠超PCR方案和MIP方案,同時(shí)根據探針的原理其均一性很好,均一性是評價(jià)捕獲技術(shù)很關(guān)鍵的參數,均一性好后續測序成本就會(huì )下降。
缺點(diǎn):容易捕獲非目標片段,造成成本增加。因為雜交前樣本會(huì )被隨機打斷一般認為500bp是比較合適的長(cháng)度,探針捕獲時(shí)可能和目標片段部分雜交,導致一些含有部分目標區段的片段被捕獲。所以雜交捕獲的特異性較差,容易捕獲非目標區段。